DB3311/T020。1

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了“慶元香菇”首發(fā)菌株種性研制標(biāo)準(zhǔn)和各級(jí)菌種的繁殖培養(yǎng)、生產(chǎn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、檢驗(yàn)方法和保藏、運(yùn)輸條件。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于研制、生產(chǎn)、經(jīng)銷、使用“慶元香菇”菌種的單位和個(gè)人。

2定義

2.1香菇菌種

專指分類學(xué)名為L(zhǎng)entinulaedodes(Berk)Pegler，在生產(chǎn)性栽培中可長(zhǎng)出符合市場(chǎng)需求，有經(jīng)濟(jì)效益子實(shí)體的純培養(yǎng)菌絲體。本標(biāo)準(zhǔn)中的香菇菌種均指雙核菌絲體。

2.2仿生菇菌種

由龍、慶、景原木砍花栽培的香菇子實(shí)體分離篩選或段木栽培的香菇菌種馴后用于“慶元香菇”培養(yǎng)料栽培的菌種。

2.3生產(chǎn)首發(fā)菌株

它是生產(chǎn)香菇各級(jí)菌種的原始出發(fā)菌株。菌株是引進(jìn)的，必須經(jīng)有關(guān)部門驗(yàn)收,并登記確認(rèn)；菌株是選育的，必須經(jīng)有關(guān)部門驗(yàn)收、鑒定，并經(jīng)省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定或認(rèn)定，登記確認(rèn)。常以玻璃試管為容器進(jìn)行培養(yǎng)和銷售。

2.4一級(jí)種

以首發(fā)菌種的菌絲體限額繁殖的菌種，常以玻璃試管為容器進(jìn)行培養(yǎng)和銷售。由省主管部門審批，由具有一級(jí)種生產(chǎn)銷售許可證的單位限額供種。

2.5二級(jí)種

以一級(jí)種菌絲體繁殖的菌種，常以750ml透明的玻璃瓶或塑料瓶為容器進(jìn)行培養(yǎng)和銷售。由具有一,二級(jí)種生產(chǎn)銷售許可證的單位或個(gè)人生產(chǎn)銷售。

2.6三級(jí)種

以二級(jí)種的菌絲體繁殖的菌種，常以透明的玻璃瓶或塑料薄膜袋為容器進(jìn)行培養(yǎng)和銷售。由具有一,二,三級(jí)種生產(chǎn)銷售許可證的單位或個(gè)人生產(chǎn)銷售。

2.7雙核菌絲

亦稱異核體菌絲，指每個(gè)香菇菌絲細(xì)胞內(nèi)具有2個(gè)不同交配型的細(xì)胞核,它是可生長(zhǎng)子實(shí)體的結(jié)實(shí)性菌絲。

2.8鎖狀聯(lián)合

香菇雙核菌絲在細(xì)胞分裂過程中出現(xiàn)的一種特殊形態(tài)，在顯微觀察時(shí)形狀恰似是一把鎖。它是香菇菌種具有出菇能力的形態(tài)指標(biāo)之一。

2.9菌絲生長(zhǎng)速度

指香菇比核菌絲在23℃~25℃條件下的PDA培養(yǎng)基上每24h菌落直徑延伸的速度,以℃m/d表示。它是香菇菌種活力的檢測(cè)指標(biāo)這一。

2.10形態(tài)指標(biāo)

指香菇菌絲的外形和色澤等指標(biāo)。

2.11生理生化指標(biāo)

指香菇菌絲體和子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)新陳代謝的各種生理生化檢測(cè)指標(biāo)，如溫度、含水量、光線、ph值、營(yíng)養(yǎng)、呼吸量、酶的含量與變化等。

2.12栽培檢驗(yàn)

指引進(jìn)或選育的香菇菌種通過實(shí)際栽培而產(chǎn)生的效果檢驗(yàn)。這是首發(fā)菌株供種前必定要檢驗(yàn)的步驟。

2.13溫型

以香菇菌種出菇溫度范圍為指標(biāo)劃分的菌種類型?，F(xiàn)分為高溫型(15℃~25℃)，中溫型(10℃~20℃)，低溫型(5℃~15℃)和介于它們之間的若干類型。

2.14PDA培養(yǎng)基

指常用于首發(fā)菌株和一級(jí)種菌絲培養(yǎng)的葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

2.15對(duì)峙反應(yīng)

遺傳性狀不同的菌絲生長(zhǎng)相遇時(shí)的拮抗現(xiàn)象.

2.16L是香菇學(xué)名Lentinula的縮寫.

2.17S是“孢子”英文名稱的Spore縮寫.

2.18T是“組織”英文名稱的Tissue縮寫。

2.19℃r是“雜交”英文名稱的℃ross縮寫.

3菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.1種性

種性是由品種的遺傳基因和環(huán)境條件共同決定的。香菇各級(jí)菌種的種性是由首發(fā)菌株的種性和環(huán)境條件決定的。必須使用種性清楚、性狀穩(wěn)定、經(jīng)有關(guān)部門鑒定驗(yàn)收和省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)或已登記備案的品種。

3.2首發(fā)菌株的種性

指作為生產(chǎn)性栽培用種的始發(fā)菌種的種性。主要的種性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有形態(tài)區(qū)別指標(biāo)（如朵形大小、菌蓋厚薄、色澤深淺、菌柄的粗細(xì)長(zhǎng)短等），栽培區(qū)別指標(biāo)（如產(chǎn)量、穩(wěn)定性、抗逆性等），生理生化區(qū)別指標(biāo)（如溫型、適應(yīng)性、生化指標(biāo)等）。不論是引進(jìn)還是自選的首發(fā)菌株，供種前必須清楚該菌株的種性，并進(jìn)行三組重復(fù)，每組300段以上栽培試驗(yàn)，并取得穩(wěn)定的效果。一級(jí)種由經(jīng)審批、具備一級(jí)種生產(chǎn)許可證單位繁殖供應(yīng)。

3.3培養(yǎng)基配方

一級(jí)種PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，ph值自然。二、三級(jí)菌種培養(yǎng)基配方：干雜木屑78%，麥麩20%，糖1%，熟石膏1%，含水量60%，ph值自然。

3.4菌種繁殖

二級(jí)種由一級(jí)種繁殖擴(kuò)大而成，三級(jí)種由二級(jí)種繁殖擴(kuò)大而成。每支一級(jí)種試管擴(kuò)接4~6瓶二級(jí)種，每瓶750ml二級(jí)種擴(kuò)接40~50瓶（袋）三級(jí)種。

3.5菌種培養(yǎng)

3.5.1溫度

23℃~25℃

3.5.2濕度

空氣相對(duì)濕度，60%~70%；培養(yǎng)基濕度，含水率60%左右。

3.5.3光線

暗或弱散射光、無直射陽(yáng)光。

3.5.4空氣

保持通風(fēng)，空氣新鮮。

3.5.5培養(yǎng)期

在23~25℃條件下，一級(jí)種培養(yǎng)期為10~20天，二級(jí)種培養(yǎng)期35~40天，三級(jí)種培養(yǎng)期30～35天。

3.6菌種純度

3.6.1培養(yǎng)基滅菌

一級(jí)種PDA培養(yǎng)基必須9.8×10Pa，121℃滅菌45min。二級(jí)種木屑培養(yǎng)基必須10.4×10Pa，126℃滅菌2h，三級(jí)種木屑培養(yǎng)基必須126℃，10.4×10Pa滅菌2H或100℃后滅菌8~10h。

3.6.2保持種源純度

任何單位和個(gè)人不得更改引進(jìn)、鑒定、登記注冊(cè)的菌種名和編號(hào)。

3.6.3菌絲純度

菌絲生長(zhǎng)正常，色澤一致，無異色異味，無混入雜菌。

3.7菌絲外現(xiàn)形態(tài)指標(biāo)

菌絲白色，棉絮狀，在固體培養(yǎng)基上菌絲末端生長(zhǎng)整齊，呈放射狀，均勻，一級(jí)種無黃水和褐色菌斑，有少量爬壁菌絲。成熟的二、三級(jí)木屑種色澤一致，木悄呈米黃色，有香菇特有的氣味，表面無或有少量褐斑、醬色分泌物，變溫刺激和光照后有少量原基出現(xiàn)。

3.8容器

一級(jí)種的容器為直徑15mm~20mm×150mm~200mm的透明玻璃試管，帶有松緊適宜的棉花塞，培養(yǎng)基與棉塞相距2℃m~3℃m；二級(jí)種容器為750ml透明玻璃瓶或相當(dāng)容量的塑料瓶；三級(jí)種為透明的玻璃瓶、塑料瓶或相當(dāng)容量的聚丙烯菌袋，均為松緊適宜的棉塞或套環(huán)、棉花塞。

3.9保藏期

在4℃條件下，一級(jí)種保藏期為3~4個(gè)月，二、三級(jí)種的保藏期為6~8個(gè)月；菌絲在隔氧的條件下（如液體石蠟隔氧保藏）保藏期為期1年；在-196℃的液氮中保藏期為3~5年或更長(zhǎng)；液體菌種發(fā)酵期滿即使用。

3.10包裝和運(yùn)輸

一、二級(jí)種出售時(shí)棉塞應(yīng)有滅菌過的牛皮紙包裹，菌袋間有適當(dāng)?shù)拈g隔；每支、瓶、袋菌種均有菌種標(biāo)簽，批量出售的菌種有種說明書；外包裝有防雨、防潮、防高溫、防摩擦、防重壓和易碎品的標(biāo)記。菌種在菌絲正常生長(zhǎng)的溫度下非密閉包裝運(yùn)輸，高溫季節(jié)夜間或氣調(diào)運(yùn)輸。

3.11菌種標(biāo)志

除符合有關(guān)菌種規(guī)定外，還應(yīng)符合{菌種管理?xiàng)l例}有關(guān)格式，標(biāo)簽規(guī)格如下：

級(jí)別：AL―℃r

菌號(hào)：℃r―72

接種時(shí)間：

單位：

A代表一級(jí)種，B代表二級(jí)種℃r代表雜交種，T代表組織分離種，S代表孢子分離種。

4菌種質(zhì)量檢驗(yàn)方法

4.1檢驗(yàn)是香菇菌種的方法

4.1.1標(biāo)簽檢驗(yàn)

核對(duì)菌種名稱、菌種編號(hào)、確認(rèn)是香菇菌種和是已審定的菌株。

4.1.2外現(xiàn)目測(cè)菌絲檢驗(yàn)

按本標(biāo)準(zhǔn)中3。7菌絲外觀形態(tài)指標(biāo)檢驗(yàn)。

4.2檢驗(yàn)香菇菌種是活體的方法

4.2.1生長(zhǎng)現(xiàn)象檢驗(yàn)

在無菌的條件下把菌絲移植于PDA或木屑培養(yǎng)基上，置于23℃~25℃溫度下培養(yǎng)，有生長(zhǎng)現(xiàn)象。

4.2.2呼吸現(xiàn)象檢驗(yàn)

將菌絲置于20℃以下的溫度培養(yǎng)，在菌絲上方的試管壁或玻璃瓶壁有水霧或水珠出現(xiàn)。

4.3菌種純度檢驗(yàn)的方法

4.3.1目測(cè)檢驗(yàn)

按本標(biāo)準(zhǔn)中3。6菌種純度和3。7菌絲外現(xiàn)形態(tài)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)。

4.3.2培養(yǎng)檢驗(yàn)

按本標(biāo)準(zhǔn)中4。2。1生長(zhǎng)現(xiàn)象檢驗(yàn)的方法檢驗(yàn)，無發(fā)現(xiàn)雜菌。

4.4活力檢驗(yàn)的方法

4.4.1菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)檢驗(yàn)

從4℃移至23℃~25℃條件下培養(yǎng)，48h內(nèi)恢復(fù)菌絲生長(zhǎng)；在PDA培養(yǎng)基上置于23℃~25℃條件下培養(yǎng)，菌落直徑24h伸長(zhǎng)0。5℃m以上。

4.4.2顯微檢驗(yàn)

在顯微鏡下觀察，鎖狀聯(lián)合頻率高。

4.4.3呼吸量檢驗(yàn)

用華勃氏呼吸儀或氧電極測(cè)試法，測(cè)定一定容量?jī)?nèi)單位重菌絲生長(zhǎng)空間氧分壓降低程度和℃O2排出量，耗氧量大、排出℃O2量多的菌種活力強(qiáng)，相反活力弱。

4.4.4酶活性檢測(cè)

酯質(zhì)同功酶、多酚氧化酶、纖維素酶、蟲漆酶等可作為檢驗(yàn)菌種活力強(qiáng)弱的指標(biāo)之一。多酚氧化酶含量高的菌種是菌絲菌齡短、活力強(qiáng)的菌種；纖維素酶和蟲漆酶含量高的菌種是活力強(qiáng)、生物轉(zhuǎn)化率高的豐產(chǎn)菌種。

4.5菌種同拮抗檢驗(yàn)

4.5.1菌絲拮抗檢驗(yàn)

把不同來源的香菇菌絲接種在同一培養(yǎng)上，有對(duì)峙反應(yīng)的菌種是具有不同遺傳基因的菌種，沒有對(duì)峙反應(yīng)的是具有相同基因的菌種。

4.5.2同功酶測(cè)定

通過菌絲蛋白粹取后對(duì)蛋白質(zhì)中電泳層析酶譜的顯色，測(cè)出譜帶相似程度，以此檢驗(yàn)菌種間的異同和遺傳特性和相似程度。這是菌種異同程度和是否新菌株的鑒別方法之一。

4.6菌種種質(zhì)特性分子標(biāo)志檢測(cè)

以各菌株細(xì)胞中染色體中遺傳表達(dá)結(jié)構(gòu)中的大小分子或分子基因?yàn)闃?biāo)志，檢測(cè)菌種優(yōu)良程度，并限得該菌株標(biāo)志。常用的方法除同功酶譜測(cè)定外，還有電泳染色體組型脫氧核糖核酸（DNA）鑒定分析法、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析法等。