雙孢蘑菇雜交新菌株As2796選育

福建省輕工業(yè)研究所, 福州, 350005

摘要：應用酯酶同工酶為遺傳標記，在高產(chǎn)菌株(H型)與優(yōu)質(zhì)菌株(G型)的同核不育株間做了380個組合的配對雜交, 選出雜交種子一代(F1)W95-2等, 再經(jīng)單孢分離出2000多株單孢培養(yǎng)物, 從中篩選獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的雜交種子二代(F2)菌株As2796。該菌株酯酶同工酶PAGE表型為HG4型,呈典型的雜合態(tài)。菌絲培養(yǎng)特性與栽培特點與高產(chǎn)親本02相似, 在24℃仍能結菇, 平均單產(chǎn)比優(yōu)質(zhì)親本菌株8213(G型)提高50%-100%。鮮菇與罐藏質(zhì)量表現(xiàn)與優(yōu)質(zhì)親本8213相似, 經(jīng)檢驗符合部頒標準。經(jīng)89-92年三個產(chǎn)季的初篩、復篩和中型生產(chǎn)試驗，表現(xiàn)穩(wěn)定，已向全國推廣。

關鍵詞：雙孢蘑菇 雜交菌株 高產(chǎn) 優(yōu)質(zhì) 耐熱

１ 前言

雜交技術在雙孢蘑菇選育種中的應用，迅速促進了品種的改良。自從荷蘭蘑菇育種家Fritsche于1981年育成商品化雜交菌株U1與U3(Fritsche,1983), 并在歐美廣為栽培以來,新的雜交菌株在世界各地不斷推出, 目前已占蘑菇生產(chǎn)用種的65-90%。我國是雙孢蘑菇生產(chǎn)大國, 進行蘑菇雜交育種的必要性已被闡明(王澤生, 1992)。福建省輕工業(yè)研究所從1983年開始研究雙孢蘑菇雜交育種, 至今已選育出As376,As1671和As1789等遺傳上偏G型的雜交新菌株在生產(chǎn)中推廣應用， 僅在福建省的推廣面積累計即達2000多萬平方米, 比老品種8213等增產(chǎn)20%左右,在保持了優(yōu)良的鮮菇與制罐質(zhì)量的前提下,為菇農(nóng)新增5000多萬元的經(jīng)濟效益。1992-2000, 福建省輕工所又推出遺傳上呈HG4的雜交新菌株As2796, 推廣面積超過3億平方米, 累計增產(chǎn)鮮蘑菇60萬噸, 增加菇農(nóng)收入20多億元。本文報導該菌株的選育過程及其菌株特性。

２ 材料與方法

2.1 菌株

供試14株雙孢蘑菇的異核體菌株02(H2型高產(chǎn)品種, 引自荷蘭), 8213(G1型優(yōu)質(zhì)品種, 老法國種, 福建保留)等, 它們的同核體菌株361-2(Hs1), 165(Gs2)等28株(王澤生等, 1990)均由福建省蘑菇菌株研究推廣站提供。

2.2 配對雜交技術

親本菌株及配對組合的選擇方法，同核單孢的分離培養(yǎng)、鑒定與配對雜交技術, 雜交種子一代(F1)與子二代(F2)的分離、鑒定步驟均同前法(王澤生,廖劍華,1990;王澤生,王賢樵,1990; 王澤生,1991)。

2.3 篩選

2.3.1 實驗室篩選

1. 耐溫培養(yǎng)：同一菌株接種于含水65%的常規(guī)糞草管中, 分別在16, 20, 24, 28和32℃下培養(yǎng)， 每種3重復, 觀察菌株在低溫與高溫下的走菌速率。

2. 耐水培養(yǎng): 同一菌株分別接種于含水55, 65, 70和75%的糞草管中, 在24℃下培養(yǎng)， 每種3重復, 觀察菌株在偏干(55%)與偏濕(75%)情況下的走菌速率。

2.3.2 栽培篩選

1. 初篩: 所獲F1代雜交種均以床架式花盆或淺箱栽培。每個花盆或淺箱投糞草干料0.5Kg或4.5Kg, 面積為0.028M2或0.15M2。每株均做3重復, 在床架上按隨機區(qū)組排列。所獲得F2代雜交種初篩同F(xiàn)1代。

2. 復篩: 做床架式栽培, 每區(qū)面積1M2, 投糞草干料30Kg, 每菌株4重復。

3. 中型生產(chǎn)試驗: 每個菌株試驗面積不小于2000M2, 在全省東、南、中三區(qū)分別設點。

上述栽培培養(yǎng)料的配方、二次發(fā)酵堆制技術與栽培管理技術均按福建省輕工業(yè)研究所提出的福建省地方蘑菇標準（推薦）(王振川等, 1990)。在初篩與復篩中，觀察菌株的菌絲生長速率，栽培特性和產(chǎn)質(zhì)量性狀。描述方法同前（王賢樵,王澤生,1989; 王澤生, 王賢樵, 1990）。中型生產(chǎn)試驗除了做上述觀察外還需按部頒標準取樣制罐,并開罐檢驗罐藏質(zhì)量。

2.4 同工酶檢測

酯酶同工酶電泳樣品制備, 聚丙烯酰胺凝膠制備、電泳及結果分析方法均同前（王賢樵, 王澤生, 1989）。

３ 結果與分析

3.1 選育過程

以酯酶同工酶為遺傳標記，從供試異核體親本中共分離出2578個單孢培養(yǎng)物,獲得158個具有S型酶譜的推定同核體,選出Gs型培養(yǎng)物16個, Hs型培養(yǎng)物12個, HGs型培養(yǎng)物8個, 共作380個配對雜交組合。從獲得的F1代雜交種中選出HG4和HG5型菌種,并從中分離出2000多個單孢培養(yǎng)物參加同工酶鑒定分型后,有400個培養(yǎng)物進入實驗室篩選。優(yōu)選后有200個新菌株進入栽培初篩,40個進入復篩, 10個進入中試, 其中之一是As2796。它是高產(chǎn)型親株02和優(yōu)質(zhì)型親株8213的同核不育株配對雜交種W95-2(F1)的單孢分離培養(yǎng)物(F2)(圖1)。

MSI*, IE*

02 361-2(Hs1) MSI, IE

MSI, IE W95-2(HG4) As2796(HG4)

8213 As165(Gs2)

圖1 雜交新菌株As2796的選育途徑

Fig1 The breeding Program of the hybrid strain As2796

*MSI: Monospore isolation, 單孢分離; IE: Isozyme examination, 同工酶檢測

3.2 生物學特性

3.2.1 在PDA培養(yǎng)基上菌絲呈銀白色, 基內(nèi)和氣生菌絲均很發(fā)達, 生長速度中等偏快, 在麥?；蚣S草培養(yǎng)基上菌絲生長快且強壯有力,一般不結菌被。

3.2.2 在含水量為55, 65, 70或75%的糞草料中, 菌絲生長速率相近, 最適65-70%。在16-32℃下菌絲均能生長, 最適24-28℃(表1)。結菇溫度10-24℃, 最適14-20℃。表現(xiàn)出較強的適應性, 尤其是耐熱能力, 保持了02的特點, 即使在32℃下培養(yǎng)， 菌絲也不死亡而且仍能生長。

3.2.3 酯酶同工酶遺傳型為HG4型, 呈典型的雜合態(tài)(圖2), 1989-2000年間所測無性繁殖(轉(zhuǎn)管)培養(yǎng)物的PAGE表型穩(wěn)定。

表１ 不同試驗條件下各菌株在堆肥培養(yǎng)基上的菌絲生長速率（mm/day）

Table1 Mycelial growth rate (mm/day) of different strains on compost medium under

different experimental conditions

菌 株

處 理

濕度: 65 65 65 65 55 65 70 75%

溫度: 16 24 28 82 24 24 24 24℃

As1671

As1789

8213

As2796

02

ZN1

2.0 3.3 3.7 0 3.3 3.3 3.4 2.9

1.6 4.0 2.6 0 3.2 4.0 3.9 3.7

2.2 3.9 2.8 0 3.5 3.9 3.2 3.1

1.6 3.7 3.3 1.5 3.1 3.7 3.6 3.5

2.2 3.7 3.2 1.1 3.2 3.7 3.8 3.5

1.9 3.4 3.2 0 3.3 3.4 3.8 3.3

* 表中數(shù)據(jù)均為三重復的平均數(shù)

圖2 雜交菌株As2796及其異核與同核親本(菌絲)樣品的酯酶PAGE表型

Fig2 The PAGE patterns of EST from the mycelium of the hybrid strain As2796 and its homo or heterokaryotic parents. G1:8211, Gs2:As165, HG4: As2796, Hs1: 361-2, H2: 02

3.3 栽培特性

As2796適用于經(jīng)二次發(fā)酵的糞草料栽培, 表現(xiàn)出耐肥, 耐水和耐高溫的特點, 要求每平方米投料量30-35Kg, C:N≈28-30:1, 含氮量1.4-1.6%, 含水量65-68%, pH值在7左右, 正常管理的噴水量不少于高產(chǎn)菌株。菌種播種后萌發(fā)力強，菌絲吃料速度中等偏快，生長強壯有力，抗逆性較強，尤為耐高溫。菌絲爬土速度中等偏快，紐結能力強，紐結發(fā)育成菇蕾或膨大為合格菇的時間較長，因此開采時間比一般菌株遲3天左右。該菌株基本單生，成菇率高(90%以上), 成品率高(80%以上), 1-4潮產(chǎn)量分布較均勻(圖3), 轉(zhuǎn)潮不太明顯, 后勁強, 有利加工廠生產(chǎn)。氣溫超過20℃,甚至達到24℃時一般還不會死菇, 可比一般菌株提前15天左右栽培。不宜薄料栽培, 料含氮量太低或水分不足都會影響產(chǎn)量或產(chǎn)生莆菇和空腹菇等質(zhì)量不良現(xiàn)象。

圖3 不同遺傳型菌株床栽產(chǎn)量結構比較(90-91產(chǎn)季栽培;每平方米面積收菇量)

Fig.3 The fruiting modes of the strains with different genetic types cultivated n shelf system during 1990-1991 growing season

■ As2796 □× ZN1 □ 8213

3.4 鮮菇與制罐質(zhì)量

鮮菇子實體呈中等大小, 直徑一般為3.0-3.5cm。外形圓整, 色澤潔白, 無鱗片, 有半膜狀菌環(huán)。菌蓋厚, 柄中粗、直短，組織結實，菌褶緊密、細小、色淡，無脫柄現(xiàn)象(圖4)。每公斤含菇90-110粒(表2)。通風口或陽光照射, 菌蓋表面呈淺棕色, 漂洗后仍呈白色。制罐平均預煮得率65%, 噸耗900Kg, 整菇率50%, 開罐后色澤正常，湯汁清晰, 組織結實, 風味好, 未見發(fā)灰黑現(xiàn)象(表3)。質(zhì)量明顯優(yōu)于高產(chǎn)菌株(H型)而與優(yōu)質(zhì)菌株(G型)(王賢樵等,1989)相似, 符合部頒標準。

表2 As2796在不同試驗階段平均單菇重(g)

Table 2 The average weight (g) of one mushroom of As2796 in different fruiting trials

產(chǎn) 季 8211 8213 As2796 02 ZN1

1989-1990 (花盆初篩) 6.3* 6.5 6.0 5.9 4.6

1990-1991 (淺箱初篩) 9.0 8.3 10.0 5.8 6.3

1990-1991 (床架復篩) 10.3 12.1 8.0

1991-1992 (床架復篩) 9.6 9.7 11.0 6.0 8.1

* 表中數(shù)據(jù)均為每產(chǎn)季各抽檢15次的平均數(shù)。

表3 As2796 罐藏試驗情況

Table 3. Data of canning test of mushroom of As2796

取樣重量 預煮后 一級品(整菇) 開罐檢驗

日期 Kg 重量 得率 重量 %

91.11.23 10.65 7.00 65.92 3.634 51.92 色澤正常,組織結實致密,風味好

92.1.4 10.60 6.75 65.56 3.135 47.99 色澤正常,組織結實,風味好

平均 65.74 49.96

* 表中數(shù)據(jù)由廈門罐頭廠提供。

圖4 02, As2796和8213鮮菇縱切面圖

Fig4 The longitudinal sections of mushrooms of 02, As2796 and 8213

3.5 栽培與產(chǎn)量表現(xiàn)

經(jīng)過89-92三個產(chǎn)季的初篩、復篩和中型生產(chǎn)試驗，結果表明As2796栽培性狀穩(wěn)定, 適應性強, 單產(chǎn)比8213等老品種增加50-100%, 與高產(chǎn)品種相近。大面積栽培平均單產(chǎn)每平方米7.5公斤, 規(guī)范化栽培單產(chǎn)每平方米9.0公斤以上, 高產(chǎn)戶可達每平方米15.0公斤。

表4數(shù)據(jù)表明, As2796單產(chǎn)比G型親本8213提高80%以上, 比偏G型雜交種1671, 1789等增加40-50%, 而和H2型親本02, H1型雜交種U3的產(chǎn)量相似。

表4 1989-91產(chǎn)季省蘑菇站初篩與復篩栽培試驗結果(Kg/M2, 采收時間60天)

Table 4 The cultivation results of the different strains for initial selection in FMRDS

during 1989-1991 growing seasons (yield: Kg/M2 during 60 days)

菌株 1671 8213 As2796 As2768 02 U3

1989-90產(chǎn)季 6.2 4.5 9.3 10.3 8.5 10.4

(花盆) 6.2 5.0 9.3 9.7 9.4 8.4

6.9 5.4 10.2 8.5 9.1 10.0

平均 6.4 5.0 9.6 9.5 9.0 9.6

1990-91產(chǎn)季 8.1 6.1 10.7 11.2 10.1 8.4

(淺箱) 8.1 6.1 11.9 9.9 12.6 10.1

7.3 6.4 11.1 12.7 11.1 10.7

平均 7.8 6.2 11.2 11.3 11.3 9.7

表5數(shù)據(jù)表明As2796在全省各中試點表現(xiàn)出適應性廣, 穩(wěn)定性強和高產(chǎn)(比其它審定品種增產(chǎn)30-50%)優(yōu)質(zhì)(符合制罐標準)的特點。1992年3月經(jīng)福建省蘑菇菌種審定委員會批準作為試推廣用種(第3號公告)，1993年3月批準作為正式推廣用種(第4號公告)。

表5 1991-1992產(chǎn)季As2796在全省多點中型生產(chǎn)試驗情況*

Table 5 The cultivation results of As2796 in Fujian during 1991-1992 growing season

地區(qū)

面積

栽培表現(xiàn)

質(zhì)量概況

產(chǎn)量概況

廈門：

罐頭廠

蘑菇站

10萬M2

栽培粗放易管理, 耐高溫, 耐肥, 耐水,不易死菇

子實體圓整、結實,每公斤90-100粒,菌褶小、色淺。罐藏符合部頒質(zhì)量標準

平均單產(chǎn)10Kg/M2, 比8213等高產(chǎn)50-60%

莆田:

罐頭廠

蘑菇站

5.2萬M2

菌絲生長速度中等偏快,耐肥,耐水, 耐高溫,抗逆性較強。無菌被, 結菇能力強,基本單生,成菇率高,后勁足

子實體中等大小,組織緊密,每公斤100粒左右,菌褶色淡,柄粗,短直,無菌環(huán),有菌膜,一級菇18%,二級78%,菜菇4%,罐藏符合部頒質(zhì)量標準

平均單產(chǎn)9.2 Kg/M2, 最高達15.4 Kg/M2, 比其它省定菌株增產(chǎn)50%左右

福州:

連江

長樂

3.33萬M2

3.33萬M2

栽培粗放, 耐高溫, 不易死菇

子實體蓋厚,色白，柄短,菇結實,每公斤100粒左右, 普遍反映質(zhì)量好

連江平均單產(chǎn)9.2 Kg/M2, 長樂平均單產(chǎn)8.5 Kg/M2

福安:

罐頭廠

食用菌辦

1.45萬M2

栽培粗放, 耐高溫, 不死菇

子實體圓整，蓋厚,色白，柄短。溫度高濕度低時,個別出現(xiàn)”空腹”。罐藏符合部頒質(zhì)量標準

平均單產(chǎn)8.9 Kg/M2, 比其它菌株高58%

壽寧:

蘑菇辦

0.133萬M2

菌絲長勢粗壯發(fā)達, 速度中偏快, 爬土能力中偏強, 對溫度適應范圍廣, 耐肥、水,紐結能力強,成菇率高

菌蓋圓整,中等偏大,組織結實,柄中粗短,質(zhì)量好

平均單產(chǎn)7.5 Kg/M2, 比8213等老品種增產(chǎn)55%

* 表中數(shù)據(jù)由各中型生產(chǎn)試驗產(chǎn)區(qū)提供。

表6數(shù)據(jù)表明As2796在福建的推廣應用面積逐年增加，已占全省用種量的90%以上,平均單產(chǎn)穩(wěn)定在7.5-15.0 Kg/M2。其中規(guī)范化栽培單產(chǎn)提高到11 Kg/M2以上，高產(chǎn)戶可達18 Kg/M2 (詳見附件4-2)。1992-2000年(8個產(chǎn)季)As2796在福建省已推廣應用17268萬M2, 其它審定品種4312萬M2, 總21580萬M2, As2796平均占80%，1995-96起均占90%以上。

表6 1992-2000年As2796在福建省栽培情況

Table 6 The results of As2796 cultivated in Fujian during 1992-2000 growing season

產(chǎn)季

菌株

栽培面積(萬M2)

占全省用種量 %

平均單產(chǎn)(Kg/M2)

1992-1993

As2796

其它

613

1627

27.5

72.5

7.5-15.0

5.5-7.5

1993-1994

As2796

其它

1505

735

67.2

32.8

7.5-15.0

5.5-8.5

1994-1995

As2796

其它

2000

850

70.2

29.8

7.5-15.0

5.5-9.5

1995-1996

As2796

其它

3000

300

90.9

9.1

7.5-15.0

5.5-9.0

1996-1997

As2796

其它

2400

200

92.2

7.8

7.5-15.0

5.5-9.0

1997-1998

As2796

其它

2500

200

92.6

7.4

7.5-15.0

5.5-8.5

1998-1999

As2796

其它

2600

200

92.9

7.1

7.5-15.0

5.5-9.0

1999-2000

As2796

其它

2650

200

93.0

7.0

7.5-15.0

5.5-9.0

４ 問題與討論

4.1 As2796的最大特點是耐熱, 把雙孢蘑菇結菇適宜溫度從16℃左右擴展到12-20℃, 使栽培期可前后各增加15天, 延長了收菇期。但當氣溫低于10℃時, 它的鮮菇質(zhì)量不如較高溫度時好, 因此可以通過控制通風量與噴水量, 盡可能不出菇, 待溫度回升時再調(diào)水出菇, 確保高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)。另外要防止菇房晝夜溫差太大(>10℃)而引起硬開傘。

4.2 As2796的產(chǎn)量結構均勻, 主要表現(xiàn)在床面上紐結、菇蕾、扣菇和成菇同時存在。邊采收，邊紐結而且不易死菇。因此要求對床面上的成菇要及時采收。床面菇密時,直徑2.5-3.0cm即應采收,一般情況下3.0-3.5cm為宜。留大菇既影響周圍小菇生長又影響質(zhì)量反面達不到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目的。

4.3 水分管理是As2796高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的關鍵技術。

1.噴結菇重水在菌絲爬土至離覆土層表面0.5-1.0cm時進行,隨后加大通風量,控制在此區(qū)域紐結成菇,若紐結過于表層,結菇太密易擠成畸形且影響后期產(chǎn)量。若發(fā)現(xiàn)紐結過于表層,可再覆一層細土。

2.噴出菇重水,應在噴結菇重水5天后,菇蕾長至黃豆大以上時進行,以水不漏至培養(yǎng)料為準則。每潮菇采收后均應去除根頭，補土并停止噴水2-3天,讓菌絲恢復生長后再行水管。

3.當菇房濕度偏低,覆土層較干時,均應先調(diào)菇房空間濕度,再調(diào)覆土含水適宜后,噴出菇重水。否則易造成子實體過干又突然大量吸水，細胞膨大異常迅速而造成空腹。

4.4 As2796具有適應性強,單產(chǎn)高,鮮菇質(zhì)量優(yōu)良,制罐整菇率高等優(yōu)點。它的鮮菇含水量較高，鮮銷質(zhì)量優(yōu)良，但加工罐頭時，預煮得率(65%)介于高產(chǎn)型(62%)與優(yōu)質(zhì)型(68%)之間,仍有待于改良,進一步提高罐頭加工廠的效益。

4.5在篩選栽培中可觀察到As2796與近年從國外引進的雜交菌株U1,R1等(王澤生,1992)相比更適于在我省推廣應用，這證明選育適合我國目前生產(chǎn)條件的雜交菌株是必須的也是可行的。

4.6 雜交菌株可用液氮來長期保藏, 但是常規(guī)保藏的使用年限一般僅7-8年, 隨后可能逐漸發(fā)生退化。用組織分離、多孢分離難以復壯雜交菌株(Fritsche,1991), 單孢分離存在著巨大的變異性(王澤生等,1989,1991),篩選技術要求高,工作量較大(王澤生等,1990a,b)。因此要求對遺傳上呈典型雜合態(tài)的雜交菌株As2796在沒有技術條件保證情況下不要進行以生產(chǎn)菌種為目的的孢子分離培養(yǎng)或組織分離培養(yǎng)，以防發(fā)生遺傳變異或退化而造成經(jīng)濟損失與管理混亂。

參 考 文 獻

1. Fritsche,G.1983. Breeding Agaricus bisporus at the Mushroom Experimental Station, Mushroom J. 122:49-53.

2. Fritsche, G.1991. Maintenance, Rejuvenation and improvement of HORST-U1, Genetic and breeding of Agaricus, Proceedings of the International Seminal on Mushroom Science, Horst, The Netherlands, 14-17, May, 1991:145-152.

3. H.C.Wang & Z.S.Wang,1989. The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis. Mushroom Science 12(1):87-100.

4. Z.S.Wang & H.C.Wang 1989. Study on the genetic variation of Agaricus bisporus, Mushroom Biotechnology, Proceedings of the International Symposium on Mushroom Biotechnology, Nanjing, China, 6-10, November, 1989:329-338.

5. Z.S.Wang & J.H.Liao 1990. Study on the crossbreeding techniques of Agaricus bisporus, Microl.Neotrop. Apl. (3): 1-12.

6. Z.S.Wang & H.C.Wang 1990. Isozyme patterns and charateristics of hybrid strains of Agaricus bisporus, Microl. Neotrop.Apl.(3):19-29.

7. Z.S.Wang, J.H.Liao, F.G.Li & H.C.Wang 1991. Studies on the genetic basis of esterase isozyme loci Est A,B and C in Agaricus bisporus, Mushroom Science 13(1):3-9.

8. 王澤生,1992,雙孢蘑菇雜交育種研究進展,中國食用菌，11(4):10-12.

9. 王澤生,1991,應用同工酶電泳法分析雙孢蘑菇白色菌株間的種內(nèi)親緣關系,福建食用菌，1(2):20-25.

10. 王振川,王賢樵,柯家耀,1990,雙孢蘑菇栽培規(guī)程,蘑菇菌種及蘑菇罐頭標準綜合體,FDBT/QB 33.1-33.9-90, p.14-20.

Studies on breeding hybrid strain AS2796

of Agaricus bisporus for canning in China

Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005, P.R.China

ABSTRACT: Using esterase isozyme as a genetic marker, some hybrid F1 progenies were obtained from 380 mating combinations which were made between homokaryotic cultures from the strains of high yield (type H) and those of good quality (type G). The hybrid F2 As2796 with characteristics of high yield, good quality and heat resistance was selected from 2000 monospores cultures isolated from the F1 progenies. As2796 has a typical heterozygous PAGE pattern, type HG4 of esterase isozyme, cultural behaviour similar to that of the parent 02 (type H2) and can fruit even at 24℃. Also, As2796 showed good stability fro five crops from 1990 to 1995 spread widely in China. Its average yield was 50-100% higher than that of the other parent 8213 (type G1), furthermore, its quality of mushroom was equal to that of 8213 and up to the national canning standards.

KEY WORDS: Agaricus bisporus, hybrid strain, high yield, good quality, heat resistance