王謙1，閆蕾蕾1，王超1，冀宏2，丁萬杰2，劉傳斌3，邢志華3，李寶佳3
(1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食藥用真菌研究所，保定071002；
2河北省微生物研究所，保定071051；3保定市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，保定071000)
茯苓(P0r／a COCOS)又名茯菟，屬擔(dān)子菌亞門，多孔菌科，臥孔菌屬…，是我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材，具有益脾健胃，安神守心，利水滲溫等功能[2]，開發(fā)價(jià)值及應(yīng)用前景遠(yuǎn)大。運(yùn)用發(fā)酵工程手段，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量茯苓菌絲體，進(jìn)而進(jìn)行工業(yè)化開發(fā)，這吸引了菌物學(xué)工作者的注意。本文報(bào)道了在工業(yè)發(fā)酵條件下茯苓的液體培養(yǎng)情況及其營(yíng)養(yǎng)濃縮液的相關(guān)檢測(cè)。
1材料與方法
1．1供試菌株
茯苓菌株HPC-1，由河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食藥用真菌研究所提供，4℃低溫保存，每6個(gè)月轉(zhuǎn)管一次。
1．2主要設(shè)備
P270雙層搖床，武漢科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；100L和1000L不銹鋼通用型發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Beckman Du一7型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Beekman公司出品。
1．3發(fā)酵工藝
1．3．1發(fā)酵培養(yǎng)基在適宜碳氮源試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定供試培養(yǎng)基為：玉米粉0．5％，豆餅粉0．5％，葡萄糖2．5％，酵母膏0．3％，磷酸二氫鉀0．1％，硫酸鎂0．1％，pH自然。
1．3．2發(fā)酵培養(yǎng)條件菌種使用前于室溫下活化過夜，再于25±1℃下，24h前180r／min、其后220r／rain搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)周期196h。發(fā)酵罐培養(yǎng)中，O．11rnPa空消50rain，后O．10mPa實(shí)消30min，裝液量60％，加消泡劑0．01％，冷卻至25℃壓差法接種。菌齡96～120h，通氣量1：0．5～1：1。經(jīng)工藝優(yōu)化篩選試驗(yàn)后確定的茯苓發(fā)酵工藝流程為：
放罐標(biāo)準(zhǔn)為菌絲生物量達(dá)到30g/100mL(鮮重)，無雜菌，鏡檢菌絲無破壁現(xiàn)象，鎖狀聯(lián)合豐富。醪液經(jīng)破壁處理、低溫提取、減壓濃縮后即獲得其營(yíng)養(yǎng)濃縮液，進(jìn)而進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。
1．4分析測(cè)試
1．4．1常規(guī)分析以80目銅絲網(wǎng)過濾稱重，測(cè)定菌絲體鮮重；用pHS-3型數(shù)字式pH計(jì)測(cè)定 pH值；用菲林法測(cè)定還原糖[3]；用酚一硫酸法測(cè)定多糖含量[4]；用日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸；用色譜質(zhì)譜聯(lián)測(cè)分析測(cè)定發(fā)酵液中的有機(jī)酸含量，該檢測(cè)由河北大學(xué)理化中心完成。
1．4．2營(yíng)養(yǎng)濃縮液的動(dòng)物試驗(yàn)按照衛(wèi)生部保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序與檢測(cè)方法中有關(guān)內(nèi)容和試驗(yàn)方法進(jìn)行抗疲勞作用檢測(cè)(負(fù)重游泳試驗(yàn))和免疫調(diào)節(jié)作用檢驗(yàn)(遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞試驗(yàn))，試驗(yàn)動(dòng)物由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1．4．3營(yíng)養(yǎng)濃縮液理化分析及毒性試驗(yàn)試驗(yàn)由河北省衛(wèi)生防疫站完成，急性毒性試驗(yàn)用霍恩法進(jìn)行。
2結(jié)果-9分析
2．1搖瓶試驗(yàn)
0-48h為適應(yīng)期，菌絲生長(zhǎng)緩慢；48～144h為增殖期，菌絲生長(zhǎng)速率加快；144h后則進(jìn)入穩(wěn)定期，菌絲生物量基本保持在一個(gè)水平(表1)。在正常培養(yǎng)情況下，進(jìn)入增殖期后伴隨著菌絲生物量的增長(zhǎng)，pH值急劇下降，降至2．5左右才趨于穩(wěn)定。
大部分食(藥)用菌液體深層培養(yǎng)過程中pH值變化不大，相比之下，茯苓液體深層培養(yǎng)情況較為特殊，其還原糖的消耗速率亦較靈芝和金針菇的慢[5,6]，筆者在香菇液體深層培養(yǎng)過程中亦曾發(fā)現(xiàn)同樣的情況L7 J，為此我們測(cè)定了發(fā)酵液的有機(jī)酸組成(表2)。
其中，274峰為軟脂酸十六烷酸，351峰為硬脂酸十八烷酸，二者均是亞油酸和亞麻酸的重要合成前體，哺乳動(dòng)物是不能自身合成這些生物膜的重要組成成分的。茯苓液體深層培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的軟脂酸和硬脂酸不僅具有學(xué)術(shù)價(jià)值，也具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該方向的研究將繼續(xù)深入進(jìn)行。
2．2發(fā)酵罐培養(yǎng)
由于發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)于搖瓶，因此培養(yǎng)周期較短，120h即可達(dá)到30d100mL的生物量指標(biāo)，放罐進(jìn)入后處理。研究中發(fā)現(xiàn)，將裝液量調(diào)整為50％后，可通過調(diào)整通氣量來改善發(fā)酵液中的溶氧量。在培養(yǎng)中期停止攪拌以減少機(jī)械作用對(duì)菌絲的破壞作用，是一項(xiàng)有效的工藝。菌種上罐前經(jīng)24h肉湯培養(yǎng)，結(jié)合鏡檢確認(rèn)有無雜菌感染，是一種穩(wěn)妥的菌種檢驗(yàn)方法。
2．3營(yíng)養(yǎng)濃縮液的相關(guān)檢測(cè)
培養(yǎng)120h的茯苓發(fā)酵醪液經(jīng)細(xì)胞破壁處理，低溫提取，減壓濃縮，復(fù)配和穩(wěn)定處理等步驟后即獲營(yíng)養(yǎng)濃縮液。其氨基酸總量≥480mg]lOOmL(其中44％為必需氨基酸)，多糖總量≥5．0mg／mL，總酸≥5．36％，重金屬及微生物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。毒性檢驗(yàn)結(jié)果LDso>21．5g/kg，屬于安全無毒。
2．3．1茯苓營(yíng)養(yǎng)濃縮液的抗疲勞作用 經(jīng)比較，茯苓營(yíng)養(yǎng)濃縮液可顯著延長(zhǎng)小鼠游泳耗竭時(shí)間，具有明顯的抗疲勞作用(表3)。
2．3．2茯苓營(yíng)養(yǎng)濃縮液對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射茯苓營(yíng)養(yǎng)濃縮液組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能明顯高于對(duì)照組(表4)，表明該營(yíng)養(yǎng)濃縮液具有明顯提高機(jī)體免疫功能的作用。
3結(jié)論
3．1在本研究提供的條件下，茯苓菌株HPC-1經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)120h后，生物量≥30g／100mL(鮮重)。
3．2發(fā)酵過程中pH驟降，在發(fā)酵液中檢測(cè)到了包括十六烷酸、十七烷酸和十八烷酸在內(nèi)的有機(jī)酸。
3．3營(yíng)養(yǎng)濃縮液安全無毒，多糖含量≥5．0mg／mL，氨基酸含量≥480mg/100mL，并具有顯著的抗疲勞作用和提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。
致謝：本課題得到河北大學(xué)理化中心郭志峰教授、河北醫(yī)科大學(xué)張永健教授大力幫助，在此一并致謝
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