雙孢蘑菇叢生變異分子機(jī)理的初步研究

王澤生 陳美元 廖劍華 盧政輝 郭仲杰 李洪榮

(福建省輕工業(yè)研究所, 福州, 350005)

摘要：以雙孢蘑菇正常菌株及其叢生變異菌株基因組DNA為模板，通過大規(guī)模的RAPD擴(kuò)增，找到一個(gè)隨機(jī)引物U18，能區(qū)分正常及叢生菌株。將叢生菌株特異片段制成探針，Southern雜交表明該片段在雙孢蘑菇基因組中為單拷貝序列。純化該片段并克隆到pUC-T質(zhì)粒中，序列測(cè)定表明該片段長(zhǎng)735bp，GenBank查詢結(jié)果表明該片段編碼了二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLDH)C末端173個(gè)氨基酸。

關(guān)鍵詞：雙孢蘑菇 叢生變異 分子機(jī)理 RAPD DLDH

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界上栽培最多的一類食用菌。在人工栽培中，其子實(shí)體正常的生長(zhǎng)形態(tài)為單生，菇形圓整。叢生即幾個(gè)子實(shí)體聚集而生，菌柄相連結(jié)，是雙孢蘑菇的一種異常生長(zhǎng)形態(tài)。叢生變異的菌株表現(xiàn)為大部分子實(shí)體叢生，菌蓋因相互擠壓而變形，產(chǎn)生大量的畸形菇，降低了其商品價(jià)值。叢生在國(guó)內(nèi)的蘑菇栽培中較為少見，而在國(guó)外的機(jī)械化栽培中較常見，其原因尚未明了，但前期研究表明引起叢生的原因是菌株自身的變異而非栽培條件。由于叢生變異只表現(xiàn)于子實(shí)體，在菌種階段并無(wú)異常，故難以早期預(yù)測(cè)。國(guó)外的蘑菇菌種公司及栽培農(nóng)場(chǎng)每年因叢生造成的經(jīng)濟(jì)損失曾高達(dá)數(shù)百萬(wàn)美元。目前世界上有好幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室從基因組DNA、RNA、mtDNA等不同角度探索雙孢蘑菇叢生變異發(fā)生的內(nèi)在因素。我們從基因組DNA的RAPD著手，對(duì)該變異的分子機(jī)理作了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株: 雙孢蘑菇正常菌株AA,GG及其叢生菌株(由發(fā)生叢生變異的子實(shí)體中組織分離獲得) A34,A35,A41,G26/1/2由美國(guó)Sylvan公司提供，現(xiàn)保存于福建省蘑菇菌種研究推廣站。

1.2 試劑: Dig標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒、尼龍膜購(gòu)自寶靈曼公司, 其余試劑購(gòu)自上海生工公司。

1.3 方法：

1.3.1 基因組DNA提取、PCR、RAPD分析按以前的方法[1]。

1.3.2 探針制備: 以Dig-dUTP代替dTTP, 用PCR方法制備標(biāo)記探針。

1.3.3 Southern雜交: 電泳膠經(jīng)EB染色照相后, 進(jìn)行脫腺嘌呤及變性處理[2], 再通過真空轉(zhuǎn)移將DNA轉(zhuǎn)至尼龍膜上。使用Dig標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒, 按照廠家提供的方法進(jìn)行非放射性Southern雜交及顯色。

1.3.4 目標(biāo)條帶的純化與克隆[3]：用低熔點(diǎn)瓊脂糖法對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行純化后連接到載體 pUC-T質(zhì)粒中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109, 通過藍(lán)/白法篩選克隆子, 并用雙酶切和PCR方法進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD分析:

以雙孢蘑菇健康菌株AA、GG及其對(duì)應(yīng)的叢生變異菌株A35、A41、G26/1/2等的菌絲體基因組DNA為模板, 使用75個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增, 發(fā)現(xiàn)有4個(gè)引物在不同程度上表現(xiàn)出健康與叢生菌株的差異，其中引物U18能很好地區(qū)分正常與叢生菌株。從圖1中可以看出, 在接近800bp處, 正常菌株只有一條帶，而叢生變異菌株除了產(chǎn)生該條帶外，還多出一條約750bp條帶。

M 1 2 3 4 5

　　 圖1 隨機(jī)引物U18對(duì)雙孢蘑菇正常及叢生菌株的

RAPD擴(kuò)增圖譜

　　 Fig.1 RAPD pattern of healthy and clustered strains of

Agaricus bisporus amplified by the random primer U18

　　 M道: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; 1-5道:菌株

AA, A35, A41,GG, G26/1/2總DNA的RAPD帶型。

←800bp Lane M: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; Lane 1-5:

RAPD band patterns of the total DNA of AA,A35,A41, GG,

G26/1/2.

2.2 探針制備及Southern雜交

以消毒牙簽刺取凝膠中A41的差異帶作為模板，用U18引物通過PCR方法制備差異片段的Dig標(biāo)記探針，標(biāo)記的探針初步定量為20～30ng/ul。用該探針對(duì)A41、AA總DNA的 EcoRI或BamHI酶解產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交，均只產(chǎn)生一條信號(hào)較強(qiáng)的雜交帶。該結(jié)果表明該片段在雙孢蘑菇基因組中為單拷貝序列(圖2), 說明它可能是某個(gè)特殊的基因片段，這給我們提供了進(jìn)一步研究的可能。

1 2 3 4 5 6

圖2 用叢生特異探針對(duì)雙孢蘑菇基因組DNA的Southern雜交圖譜

Fig.2 Southern blotting pattern of genomic DNA of A.bisporus with cluster-special probe

1-6道: A41總DNA/EcoRI; AA總 DNA/EcoRI; A41總DNA/BamHI; AA總DNA/ BamHI; AA總DNA; 陽(yáng)性對(duì)照.

Lane 1-6: A41 total DNA/EcoRI; AA total DNA/EcoRI; A41 total DNA/BamHI; AA total DNA/ BamHI; AA total DNA; Positive Control.

2.3 叢生差異帶的純化與克隆

叢生菌株A41　750bp處的RAPD差異條帶用低熔點(diǎn)瓊脂糖法加以純化，經(jīng)電泳驗(yàn)證后克隆到PCR產(chǎn)物克隆專用載體pUC-T質(zhì)粒中。用藍(lán)/白法從三個(gè)培養(yǎng)皿中共篩選到45個(gè)白色克隆子, 經(jīng)酚/氯仿快速裂解并電泳鑒定后獲得兩個(gè)預(yù)期大小的克隆子, 編號(hào)為No.2和No.14。進(jìn)一步用U18引物對(duì)這兩個(gè)克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 發(fā)現(xiàn)No.14克隆子擴(kuò)增出750bp條帶。用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切分析, 結(jié)果顯示No.14克隆子切出了750bp條帶（因其帶部分載體序列，實(shí)際長(zhǎng)度約800bp）。以上結(jié)果表明No.14克隆子已成功克隆到了顯示叢生差異的目標(biāo)條帶（圖3）。

1 2 3 4 5 6 M

圖3 克隆子的PCR(引物U18)及雙酶切(EcoRI+

BamHI)鑒定

Fig.3 Determination of the recombinants by PCR

(with the primer U18) and double-enzyme (EcoRI+

BamHI) digestion

1-3道: 質(zhì)粒pUC-T,克隆子No.14和No.2的PCR

←800bp 帶型; 4-6道: 質(zhì)粒pUC-T,克隆子No.14和No.2的雙

酶切帶型; M道: 100bp DNA ladder

Lane 1-3: PCR band patterns of plasmid pUC-T,

recombinant No.14 and No.2; Lane 4-6: Double-

enzyme digestion patterns of pUC-T, recombinant No.14

and No.2; Lane M: 100bp DNA ladder

2.4 克隆條帶的序列測(cè)定及分析

根據(jù)pUC-T載體上的測(cè)序位點(diǎn), 用M13正反向引物對(duì)克隆條帶進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明該片段長(zhǎng)735bp(含兩端隨機(jī)引物)。把該序列轉(zhuǎn)為其mRNA序列, 通過Genbank查詢發(fā)現(xiàn), 從mRNA的5’端開始, 該序列編碼了一個(gè)部分開放讀框(ORF), 即二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLDH) C末端的173個(gè)氨基酸。編碼序列有2或3個(gè)移碼：一個(gè)大約在210～215位置，一個(gè)在400～460之間（與其它真菌序列相比，雙孢蘑菇在此處有一20個(gè)氨基酸的非線性整合），可能還有一個(gè)在大約35位置。該ORF中剩余的下游215個(gè)堿基在Genbank中未找到明顯的同源序列。

3 討論

3.1 通過大量的RAPD實(shí)驗(yàn), 我們篩選到了U18引物, 能較好地區(qū)分雙孢蘑菇正常菌株及其叢生變異菌株, 為雙孢蘑菇叢生變異在菌種階段的早期預(yù)測(cè)提供了一種DNA水平的標(biāo)記。但由于RAPD標(biāo)記不夠穩(wěn)定, 要將其應(yīng)用于生產(chǎn)，還需獲得更多的叢生變異菌株進(jìn)行試驗(yàn), 以驗(yàn)證該標(biāo)記與叢生變異的相關(guān)性。

3.2 克隆序列編碼了DLDH　C末端的173個(gè)氨基酸, 該脫氫酶是線粒體基質(zhì)中的一種核編碼蛋白, 在細(xì)胞呼吸中起著重要作用, 不少重大的遺傳疾病都與該酶的遺傳缺陷有關(guān)。本研究結(jié)果表明了一種可能性, 即叢生變異可能與呼吸途徑有關(guān)，但這需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)論證。

3.3 在下一步的研究工作中，我們將研究在正常與叢生菌株中DLDH基因表達(dá)產(chǎn)物的差異，即DLDH酶蛋白活力的差異和mRNA的差異。如有必要，將構(gòu)建兩類菌株的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，爭(zhēng)取獲得兩類菌株完整的DLDH基因序列，通過構(gòu)建限制性酶譜或序列分析等手段，確證該基因與叢生變異的相關(guān)性，最終闡明雙孢蘑菇叢生變異的分子機(jī)理。

參 考 文 獻(xiàn)

1 陳美元,廖劍華,王澤生. 雙孢蘑菇三種類型菌株的RAPD擴(kuò)增研究. 食用菌學(xué)報(bào), 1998, 5(4):6-10.

2 路建平主編, 非放射性雜交技術(shù). 海口:南海出版公司, 1996:31-40.

3 J薩姆布魯克,E F弗里奇,T曼尼阿蒂斯著(金冬雁等譯). 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版). 北京:科學(xué)出版社, 1995:672-683.

A Preliminary Study on the Molecular Mechanism

of Clustering Variation of Agarucus bisporus

Zesheng Wang Meiyuan Chen Jianhua Liao Zhenghui Lu Zhongjie Guo　Hongrong Li

(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005)

Abstract: Using the genomic DNA of healthy strains and their clustering variation ones of A.bisporus as templates, a large scale of RAPD amplification was performed, and a random primer U18 was found to be able to distinguish the healthy and clustered strains. The probe was prepared with the cluster-special fragment. The result of Southern blotting suggested the fragment to be a single copy sequence in the genome of A.bisporus. The DNA fragment was purified and cloned into pUC-T plasmid. Sequencing result showed that the fragment has a size of 735bp, and encodes the C-terminal 173 amino acids of dihydrolipoamide dehydrogenase (DLDH).

Key Words: Agarucus bisporus, Clustering variation, Molecular mechanism, RAPD, DLDH